洪堡初次来到这新发现的南美洲大陆，大自然的一切他都感到很好奇。高山大川都留下了他攀登的足迹，奇花异草也采集了许多；从野兽隐没的原始密林，人迹罕见的热带草原，到藏匿于河床下、洞穴里的未开化的原始部落，他都进行了造访；从一只小小的飞虫，到巨大岩洞中那些灭了种的部族人的尸骨，他都收藏起来。他用探索的眼光来看这奇异世界，同时用科学的头脑思索着这一切的根源。1800年，他与邦普朗坐小船和独木舟，沿着委内瑞拉最大的河流奥里诺科河划行了.. 2760千米，对大部分无人居住的森林区进行了测量制图，证实该河通过一条支流与南美第一大河亚马逊河相通。途中遇到的艰辛是难以言喻的，他们不得不以香蕉和鱼为主食，而且还经常遭到成群蚊虫、蚂蚁和其他昆虫的叮咬，以及毒蛇、食人鱼和鳄鱼的侵袭。几乎每个人都患了热病，然而洪堡似乎有免疫力，他坚持观察并记录下各种自然现象，用仪器测定经纬度。他还收集了数以千计的植物和岩石标本，并把它们全部运往古巴。
1801年，洪堡和邦普朗又开始了对哥伦比亚、厄瓜多尔和秘鲁的安第斯山脉的探险。洪堡攀登和考察了厄瓜多尔境内的许多火山，为了收集从地球内部释放出来的气体，他一再走下活火山口中的深处。在仔细观察了安第斯山的岩石以后，他认为他的老师维尔纳关于岩石皆由水成的说法是错误的，并断言花岗岩、片麻岩和其他结晶岩都是火成岩。他和邦普朗还攀登了钦博拉索山（当时人们认为它是世界最高峰），爬到海拔.. 5878米处，这是当时人类所到过的最高点，这一记录一直维持了.. 29年之久。在高山峻岭之中，洪堡忙着用空盒气压表测定高度，用温度表测定气温，用磁力仪测定地球磁场，观察热带山区的气温、气压、植物和农业随高度不同而明显变化的有趣现象，他还记载了因缺氧而导致的高山疾病的征象。
两人后来到达秘鲁。洪堡在沿海还测量了海水的温度，他发现这里有一股从海底向上翻腾的强大的冷水流，即秘鲁寒流，后来人们也把它称为洪堡寒流。然后洪堡和邦普朗渡海到墨西哥，又到古巴。他们把积累下来的大量考察记录、图表和日记，以及约.. 6万件无价之宝的植物与岩石标本，集装成箱全部运往欧洲。1804年洪堡两人又到美国去旅行。最后他们从费城乘船离开新大陆，于该年 6月 30日返回欧洲。
他们这次在中、南美洲的旅行考察，其总行程达.. 6.5万千米，相当于绕行地球一圈半，它成了洪堡开创一生伟大事业的转折点。返归欧洲后不久，洪堡和邦普朗便留居在巴黎，埋头分析整理带回来的.. 35箱科学资料，先后达20年之久，最后写成.. 30卷本的《新大陆热带地区旅行记》。对一个刚刚从地理大发现所带来的震惊中恢复平静的世界来说，洪堡的著作就像吹来了一缕清风，它不仅充满了异乡奇域的旅游趣闻，还提供了详细的科学调查的报导。它的影响是如此之大，以至于进化论的创始者达尔文说他当年曾反复阅读了洪堡的科学旅行记录，正是它们改变了他一生的整个过程。